#9 — analisi di espressione

Ciao,
ti consiglio di utilizzare il database "Human Protein Atlas", che puoi trovare all'indirizzo http://www.proteinatlas.org

Nella Homepage troverai un campo "Search", inserisci il gene symbol dei tuoi geni d'interesse (TP53 e RB1).
Visto il tuo interesse per l'espressione in linee cellulari, nella schermata successiva dovrai cliccare - in corrispondenza del tuo gene - la scritta rosa "RNA" in corrispondenza della colonna "Cell line".
A questo punto, sulla sinistra troverai degli istogrammi viola con i valori d'espressione del gene selezionato in tutte le linee cellulari presenti nel database Human Protein Atlas.
Sia le MCF7 che le U87 sono presenti in questo database.
Cliccando sugli istogrammi vedrai anche i valori di espressione per (almeno) 2 replicati tecnici.
Poiché questo database utilizza esperimenti di RNA-Sequencing, i valori di espressione riportati sono espressi in FPKM (Fragments Per Kilobase of exon per Million fragments mapped) che sono un'unità di misura dell'espressione genica "normalizzata" (utilizzata dal software Cufflinks e descritta in Trapnell et al., 2010 su Nature Biotechnology).

In alternativa ci sarebbe la possibilità di visualizzare i valori di "coverage" (e non di espressione come FPKM) per i tuoi geni d'interesse all'interno di un browser genomico come UCSC Genome Browser, andando all'indirizzo http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway.
Per quanto riguarda quest'ultimo tipo di analisi, può essere più utile rispetto a - o può integrare - quella con Human Protein Atlas soprattutto se hai intenzione di visualizzare in maniera integrata diverse annotazioni ed altre tipologie di dati (espressione, dati di binding di fattori trascrizioni, presenza di SNP o altre variazioni etc etc.), oppure nel caso in cui tu voglia studiare diversi trascritti dello stesso gene.
In quest'ultimo caso infatti, il valore di FPKM che Human Protein Atlas riporta è una "media" del livello di espressione di tutti i trascritti di quel gene, mentre con la "visual inspection" su UCSC Genome Browser hai la possibilità di vedere l'espressione (o meglio i valori di coverage) relativi a più trascritti diversi dello stesso gene.
 
Non so se sei già pratica di questo browser, in caso contrario ti descrivo sinteticamente come fare:
Dalla schermata che ti ho "linkato", inserisci il nome del tuo gene nella sezione "Search term" e poi "submit".
Cliccando su uno qualsiasi dei link che appaiono, sarai reindirizzata alla "Navigation Page".
Qui sono visibili le annotazioni geniche (dovresti ora vedere la struttura esone/introne del tuo gene).
Dovresti scorrere sotto e trovare una serie di Tracks, "Mapping and Sequencing", "Genes and gene predictions" etc etc.
Nella sezione "Expression" delle tracks, cerca "ENC RNA-seq…".
Dal menù a tendina seleziona "show", poi "refresh".
Torna sotto poi clicca sul link "ENC RNA-seq…".
Qui sono presenti i dataset di espressione (mediante RNA-Sequencing) prodotti dal consorzio internazionale ENCODE ("ENCODE RNA-seq Tracks"). Le track relative alle MCF7 e U87 sono presenti solo in alcune di queste tracks.
In particolare, dovrebbero essere in "Caltech RNA-seq" (ossia RNA-seq di ENCODE/Caltech) ed "HAIB RNA-seq" (ossia RNA-seq di ENCODE/HAIB).
Clicca su "Caltech RNA-seq", deseleziona tutto e seleziona solo "MCF-7" (ENCODE/Caltech ha solo dati per le MCF7), facendo attenzione che sotto le tracks siano impostate come "full". Clicca "submit".
Ripeti la procedura per le tracks "HAIB RNA-seq", selezionando "U87" (ENCODE/HAIB ha solo dati per le U87). Controlla che le tracks siano impostate come "full". Clicca "submit".
Dal menù a tendina nel browser cerca "ENC RNA-seq…" e seleziona la modalità di visualizzazione "full" per entrambe le tracks, poi "submit".
Ora le tracks saranno visibili nel tuo browser.
Dovresti visualizzare queste tracks come "picchi" e "valli" di colore nero.
I valori numerici sul lato sinistro del browser indicano il "coverage".

Spero di esserti stato d'aiuto.

Valerio